Pcr rflp là gì? Các công bố khoa học về Pcr rflp

Hai chủng phân lập của virus parvo ở chó (CPV) đã được tách từ các cá thể chó bị ảnh hưởng bởi tình trạng tiêu chảy xuất huyết nghiêm trọng. Tính đặc hiệu kháng nguyên loại 2b đã được dự đoán qua phân tích kháng nguyên với kháng thể đơn dòng và phân tích đặc điểm PCR với các mồi đặc hiệu loại. Tuy nhiên, phân tích trình tự của gen mã hoá protein vỏ nang đã tiết lộ hai sự thay đổi acid amin. Một trong những sự thay đổi này ảnh hưởng đến vị trí 426 (Asp thành Glu), tại một vị trí kháng nguyên chính của vỏ nang virus, xác định sự thay thế của một dư lượng độc nhất cho loại 2b của CPV. Sự thất bại của các phương pháp phân loại hiện có trong việc phân biệt biến thể kháng nguyên này đã được khắc phục bằng sự phát triển của một thử nghiệm RFLP.

Ba dạng nhiễm sắc thể của Anopheles gambiae s.s., được gọi là Bamako, Mopti và Savanna, đã được nghiên cứu bằng các phương pháp xét nghiệm PCR phân tích dựa trên phân tích DNA ribosome liên kết X (rDNA). Nghiên cứu được thực hiện trên một đoạn 1.3 kb chứa một phần của vùng mã hoá 28S và một phần của vùng đệm giữa các gen. Vật liệu được khuếch đại đã bị cắt với mười bốn enzyme hạn chế để phát hiện các đa hình chiều dài đoạn hạn chế (RFLPs). Các enzyme Tru9I và HhaI đã tạo ra các hình thái dải DNA phân biệt Mopti với Savanna và Bamako; hơn nữa, một hình thái 'lai' riêng biệt được nhận diện trong thế hệ con F1 nữ từ cuộc lai giữa Mopti với một trong hai dạng nhiễm sắc thể còn lại. Ý nghĩa chuẩn đoán của xét nghiệm PCR‐RFLP đã được kiểm chứng trên 203 con cái kiểu nhân thể từ các mẫu trường được thu thập tại hai làng ở Mali và một làng ở Burkina Faso. Sự đồng thuận được quan sát giữa phân loại nhiễm sắc thể và phân loại phân tử. Không có hình thái phân tử 'lai' nào được phát hiện ngay cả trong số những cá thể mang kiểu nhân thể hiếm gặp có thể được sinh ra từ giao phối giữa Mopti và Savanna. Kết quả khẳng định các quan sát trước đó chỉ ra sự cản trở dòng gen trong An. gambiae s.s. và khẳng định tình trạng cụ thể của các đơn vị phân loại được đề xuất dựa trên cơ sở di truyền nhiễm sắc thể.

Tóm tắt: Chúng tôi đã phát triển một kỹ thuật mới để phân loại gen HLA lớp II bằng cách tiêu hóa các gen được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các endonuclease hạn chế (phương pháp PCR-RFLP). Phương pháp PCR-RFLP này là một kỹ thuật phân loại hiệu quả và thuận tiện cho các alen lớp II. Tuy nhiên, những đoạn nhỏ hoặc các băng gần nhau trên gel polyacrylamide đôi khi cản trở việc phân tích chính xác các băng RFLP. Hơn nữa, các enzyme hạn chế mà chúng tôi đã báo cáo trong các bài viết trước đây không đủ để xác định kiểu gen của tất cả các cá thể dị hợp. Ở đây, chúng tôi báo cáo một phương pháp PCR-RFLP cải tiến sử dụng một số enzyme hạn chế thông tin có một vị trí cắt đơn lẻ hoặc, ngược lại, không có vị trí cắt trong vùng DNA được khuếch đại, tùy thuộc vào các alen HLA, làm cho việc đọc các mẫu băng RFLP dễ dàng hơn rất nhiều. Mỗi exon thứ hai của gene HLA-DQA1 hoặc -DPB1 được khuếch đại chọn lọc từ DNA gen của 70 dòng tế bào B HLA đồng hợp và 100 người Nhật khỏe mạnh bằng PCR. DNA được khuếch đại được tiêu hóa bằng các endonuclease hạn chế và sau đó được điện di để kiểm tra việc cắt hay không cắt DNA. ApaLI, HphI, BsaJI, Fokl, MboII và Mnll có khả năng phân biệt tám alen của gene DQA1. Tương tự, 19 alen của gene DPB1 có thể được phân biệt với các enzyme Bsp1286I, Fokl, Ddel, BsaJI, BssHII, Cfr13I, Rsal, EcoNI và AvaII. Phương pháp PCR-RFLP đã được sửa đổi này có thể được áp dụng thành công cho các cá thể dị hợp. Do đó, phương pháp này đơn giản về kỹ thuật và thực tiễn hơn cho công việc phân loại HLA thường quy so với phương pháp PCR-RFLP trước đây của chúng tôi.

Chúng tôi trước đây đã xác định một allele của gen SP‐A2 ở người có tần suất xuất hiện cao hơn trong một quần thể RDS [12]. Do tầm quan trọng của SP‐A trong chức năng phổi bình thường và vai trò mới nổi của nó trong phòng vệ tự nhiên của cơ thể cùng với việc điều chỉnh các quá trình viêm, chúng tôi muốn mô tả rõ hơn các kiểu gen của cả gen SP‐A1 và SP‐A2. Đã xác định rằng SP‐D cũng có các vai trò tương tự trong phản ứng miễn dịch. Vì vậy, trong báo cáo này chúng tôi 1) mô tả một phương pháp PCR cRFLP không phóng xạ mới để phân tích kiểu gen cả SP‐A và SP‐D; 2) mô tả hai đa hình biallelic chưa được công bố trước đó trong gen SP‐D; 3) trình bày chuỗi một phần của một allele mới SP‐A1 (6A¹⁴) và mô tả các allele mới khác của SP‐A1 và SP‐A2; và 4) mô tả thêm các phương pháp đánh giá kiểu gen SP‐A. Khả năng xác định chính xác hơn và hiệu quả hơn các mẫu từ những cá nhân mắc các bệnh phổi khác nhau sẽ hỗ trợ cho các nghiên cứu liên kết dựa trên quần thể và gia đình. Các đa hình gen có thể được xác định và giải thích một phần về tính nhạy cảm bệnh tật của cá nhân và/hoặc hiệu quả điều trị.

Tóm tắt: Chúng tôi đã giới thiệu trước đây về định typ gen HLA‐DQA1,‐DPB1 và DQB1 bằng phương pháp PCR‐RFLP sửa đổi sử dụng một số enzyme cắt giới hạn thông tin, mà có hoặc không có vị trí cắt trong vùng DNA khuếch đại, tùy thuộc vào các alen HLA, làm cho việc đọc mẫu băng RFLP dễ dàng hơn nhiều. Trong nghiên cứu này, 43 alen HLA‐DRB1, ngoại trừ DRB1*1103 và *1104 không có enzyme cắt giới hạn nào để phân biệt một cách riêng biệt, có thể được xác định bằng phương pháp PCR‐RFLP sửa đổi kết hợp với 7 cặp mồi cụ thể cho từng nhóm. Không thể phân biệt được DRB 1*0701 và DRB1*0702 khi chúng giống hệt nhau ở exon thứ hai của DRB1. Đối với khuếch đại gene DRB1 của các kháng nguyên liên quan đến DRI‐DRB1, DR2‐DRB1, DR4‐DRB1, DR7‐DRB1, DR9‐DRB1, DRw10‐DRB1 hoặc DRw52 (DR3, w11, w12, w13, w14, và DRw8), exon thứ hai của gene DRB1 đã được khuếch đại chọn lọc bằng cách sử dụng từng mồi cụ thể cho nhóm từ DNA gen của 70 dòng tế bào B đồng hợp HLA và người Nhật khỏe mạnh bằng PCR. DNA khuếch đại đã được tiêu hóa bằng các enzyme cắt giới hạn và sau đó được điện di kiểm tra đơn giản để xác định việc cắt hay không cắt DNA, mặc dù một số alen chỉ có thể được phân biệt sau khi kiểm tra các mẫu băng RFLP được tạo ra và trong một số trường hợp sử dụng kỹ thuật tiêu hóa đôi với hai enzyme cắt giới hạn. Phương pháp PCR‐RFLP sửa đổi này có thể được áp dụng thành công cho tất cả các kiểu gen dị hợp DRB1 có thể có, mặc dù thực tế có 15 cặp dị hợp không thể phân biệt lý thuyết bằng phương pháp PCR‐SSO, vì phương pháp PCR‐RFLP có thể cho biết liệu hai vị trí đa hình có liên kết với nhau (vị trí cis) hay nằm trên một nhiễm sắc thể khác (vị trí trans) bằng cách kiểm tra chiều dài các băng RFLP được tạo ra với kỹ thuật tiêu hóa đôi. Do đó, phương pháp PCR‐RFLP về kỹ thuật là đơn giản, thực tiễn và tiết kiệm chi phí cho việc xác định các alen HLA‐DRB1 trong công việc xác định HLA thường xuyên.